1.样本类型和采(cai)集：

血清：将收(shou)集于(yu)血清(qing)分离(li)管的全血标本在室(shi)温放(fang)置0.5-2小时或(huo)4℃过夜，然后1000×g离心(xin)20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存(cun)，但应避免反复冻融。
 血(xue)浆：用EDTA或(huo)肝素作(zuo)为抗凝剂采(cai)集标本，并将(jiang)标本在采(cai)集后的30分钟(zhong)内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻(dong)融(rong)。

组织匀浆：用预(yu)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织(zhi)，去除残留血液(ye)（匀(yun)浆中(zhong)裂(lie)解的(de)红细胞会影响测(ce)量结果），称(cheng)重后将(jiang)剪碎的(de)组织(zhi)与(yu)对应体(ti)积(ji)的(de)PBS（一般按1:9的重量体(ti)(ti)积比(bi)，比(bi)如1g的组(zu)织样品对应9mL的PBS，具(ju)体体积(ji)可根据(ju)实验需要(yao)适当调整，并做好记录(lu)。推(tui)荐在PBS中(zhong)加(jia)(jia)入蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制剂）加(jia)(jia)入玻璃匀(yun)浆器中(zhong)，于冰上充分研磨。为了进一步(bu)裂(lie)解组织细胞，可以对匀(yun)浆液进行超声(sheng)破(po)碎(sui)，或反(fan)复冻融。最后将匀(yun)浆液于5000×g离心(xin)5~10分钟，取上清即可检测，或(huo)将上(shang)清(qing)置(zhi)于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但应避免反(fan)复冻融。

细胞裂解(jie)液: 吸弃(qi)培养液，用PBS（0.01 M，pH 7.4）将细(xi)胞(bao)洗一遍(bian)。用(yong)细(xi)胞(bao)刮刮下细(xi)胞(bao)，加入(ru)2-5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4）。悬(xuan)浮细(xi)胞(bao)可(ke)省(sheng)略(lve)。收集细(xi)胞(bao)悬(xuan)液(ye)，4℃ 1000×g离(li)(li)心10min，弃去培养(yang)基，用(yong)预冷(leng)(leng)的(de)(de)PBS润洗3次。加入(ru)适量(liang)的(de)(de)预冷(leng)(leng)PBS或非变性(xing)细(xi)胞(bao)裂(lie)解(jie)(jie)(jie)液(ye)（临用(yong)前加入(ru)蛋白(bai)酶抑制剂(ji)）重悬(xuan)细(xi)胞(bao),通常(chang)6孔板(ban)一个孔的(de)(de)细(xi)胞(bao)量(liang)需要150-250μL PBS重悬(xuan)。 将样品(pin)(pin)放(fang)入(ru)-20℃或-80℃，使(shi)样品(pin)(pin)冷(leng)(leng)冻，再放(fang)室(shi)温解(jie)(jie)(jie)冻样品(pin)(pin)，反复冻融3次，使(shi)细(xi)胞(bao)充分(fen)裂(lie)解(jie)(jie)(jie),也可(ke)将样品(pin)(pin)进行(xing)超声(sheng)破碎，以达到裂(lie)解(jie)(jie)(jie)的(de)(de)目的(de)(de)。4℃ 10000×g 离(li)(li)心10min，除(chu)去细(xi)胞(bao)碎片(pian)，取上清(qing)即可(ke)检测，或将上清置于-20℃或(huo)-80℃保存，但应(ying)避免反复冻融。

细胞(bao)培(pei)养物上(shang)清(qing)或其它生物标本：请(qing)1000×g离心20分(fen)钟(zhong)，取上清即可检(jian)测，或(huo)将上清置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但应避免(mian)反复(fu)冻融。

2.样(yang)本(ben)保存(cun)和稳定性

样本在(zai)2-8℃条件下，可以(yi)储存72h，在- 20℃或(huo)-80℃可(ke)以储存6个(ge)月(yue)及以上。样本收集后，不是(shi)一次检测完(wan)，请按一次用量分(fen)装(zhuang)冻(dong)存，避(bi)免反复(fu)冻(dong)融(rong)。

步(bu)骤：

1. 编(bian)号(hao)(hao)：将样品对应微孔按序编(bian)号(hao)(hao)，每板应设(she)阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加(jia)样品及酶标(biao)试剂(ji)，其余各步操作相同）。

2. 加样：分别在(zai)阴、阳性(xing)对照孔中加入(ru)阴性(xing)对照、阳性(xing)对照50μl。然后在待(dai)测样(yang)(yang)品(pin)孔(kong)先(xian)加(jia)(jia)样(yang)(yang)品(pin)稀释(shi)液(ye)40μl，然后再(zai)加(jia)(jia)待(dai)测样(yang)(yang)品(pin)10μl。加(jia)(jia)样(yang)(yang)将样(yang)(yang)品(pin)加(jia)(jia)于酶标(biao)板孔(kong)底部，尽量不(bu)触及孔(kong)壁，轻轻晃(huang)动混(hun)匀。

3. 温(wen)育：用封板膜(mo)封板后置37℃温育(yu)30分(fen)钟。  

4. 配液：将30倍浓缩(suo)洗涤液用蒸馏水30倍稀(xi)释后备用。

5. 洗涤：小(xiao)心(xin)揭掉封板膜(mo)，弃去液体(ti)，甩干，每孔加满洗涤液，静置(zhi)30秒后弃(qi)去(qu)，如此重复(fu)5次，拍干。

6. 加(jia)酶(mei)：每孔加(jia)入酶(mei)标试剂50μl，空白孔除外。

7. 温(wen)育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟(zhong)。

8. 洗涤：小心揭掉封板(ban)膜，弃(qi)去液体，甩干(gan)，每(mei)孔加满洗涤液，静置30秒后弃(qi)去，如此重(zhong)复5次，拍干。

9. 显(xian)色(se)(se)：每孔先加入显(xian)色(se)(se)剂A50μl，再加(jia)入显(xian)色剂B50μl，轻轻震荡(dang)混匀(yun)，37℃避(bi)光显色10-20分钟。

10.终止(zhi)：每孔加终止(zhi)液50μl，终止(zhi)反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定(ding)：以空白孔调零，450nm波长(zhang)依(yi)序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应(ying)在加(jia)终止液(ye)后15分钟以内进行。

注意(yi)：

1. 试剂准备：试剂盒从冷藏环境中(zhong)取(qu)出应在室温平衡15-30分钟后方可使用(yong)。准备一(yi)次(ci)实验所需(xu)要(yao)的(de)酶(mei)标条，其它的(de)可从微孔(kong)板上拆下，密封，按(an)照说明书(shu)要(yao)求保(bao)存，以备下次(ci)使用(yong)。

2. 加(jia)样(yang)(yang)：实验操作(zuo)中(zhong)请使用一(yi)次性的灭菌(jun)吸头，避免污染。加(jia)样(yang)(yang)时注(zhu)意不要有(you)气(qi)泡产生，将样(yang)(yang)品加(jia)于酶(mei)标板底部，尽量不触及(ji)孔(kong)壁，轻轻晃动混匀。与反应试剂加(jia)入(ru)一(yi)样(yang)(yang)，加(jia)样(yang)(yang)过(guo)程中(zhong)第一(yi)个(ge)孔(kong)与最后一(yi)个(ge)孔(kong)加(jia)样(yang)(yang)时间(jian)间(jian)隔尽量小(xiao)（一(yi)般(ban)控(kong)制在(zai)10 分钟以内），如(ru)果太(tai)大，将会导(dao)致(zhi)不同的“预温(wen)育"时间，从而明显(xian)地影响到测(ce)量值的准确(que)性(xing)(xing)及重复(fu)性(xing)(xing)。为了测(ce)值的准确(que)性(xing)(xing)，推荐(jian)设置复(fu)孔进行实(shi)验。

3. 温(wen)育(yu)：为防止(zhi)样品蒸发，实(shi)验时(shi)请将加上盖或覆膜的酶(mei)标板(ban)置于湿盒内，以(yi)避免液体蒸发，洗(xi)板(ban)后应尽(jin)快(kuai)进行下步(bu)操作(zuo)，任何时(shi)侯(hou)都应避免酶(mei)标板(ban)处于干燥状态，同时(shi)应严格(ge)遵守给定的温(wen)育(yu)时(shi)间和温(wen)度。

4. 洗涤：浓洗涤液可能会有结(jie)晶析(xi)出，稀(xi)释时(shi)可(ke)在(zai)水浴中(zhong)加温助溶，洗(xi)涤(di)时不影响结果。充(chong)分洗(xi)涤(di)非常重要，在(zai)每次洗(xi)涤(di)过(guo)程中(zhong)，都要将洗(xi)涤(di)液(ye)(ye)*甩干。洗(xi)涤(di)过(guo)程中(zhong)反应孔(kong)内残留的洗(xi)涤(di)液(ye)(ye)应在(zai)吸(xi)水(shui)纸上拍干，勿将吸(xi)水(shui)纸直(zhi)接放入反应孔(kong)中(zhong)吸(xi)水(shui)，同时要轻(qing)轻(qing)擦除板底残留的液(ye)(ye)体和手指印，避免影响最(zui)后的酶标(biao)仪读数(shu)。如果使(shi)用自动洗(xi)板机，请(qing)在(zai)熟练使(shi)用后再(zai)用于正式(shi)实(shi)验过(guo)程中(zhong)。

5. 反(fan)应(ying)时间的控(kong)制：加入底物后请定时观察反(fan)应(ying)孔的颜色变(bian)化，如观察到颜色较深，请提前加入终止液终止反(fan)应(ying)，避免反(fan)应(ying)过强而影响酶标仪光密(mi)度读数。

6. 底(di)物(wu)：底(di)物(wu)请(qing)避(bi)光(guang)保存，在储(chu)存和温育时(shi)避(bi)免(mian)强光(guang)直接照射。